REACCIÓN DEL TEJIDO NEURAL AL DAÑO.

La degeneración axonal es un proceso que ocurre como consecuencia de una amplia variedad de trastornos metabólicos, tóxicos, hereditarios e inflamatorios. Patologías como esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica y neuropatías periféricas tienen como consecuencia la degeneración axonal. El mecanismo por el cual se inicia el proceso de degeneración walleriana es motivo de constante estudio, sugiriéndose un mecanismo de respuesta al daño similar a la apoptosis (1).

Dentro de los primeros minutos de producida la lesión, la membrana plasmática del axón se cierra. En el segmento proximal se acumula contenido axonal (neurofilamentos, vesículas, mitocondrias) debido a la interrupción del flujo axoplásmico. El segmento distal al sitio de la lesión degenera (2).

Los fenómenos más tempranos de la degeneración walleriana se visualizan a las 24 horas de producida la lesión. El evento crucial en la degeneración del segmento distal del axón lesionado es la desintegración granular del citoesqueleto y el axoplasma. La lesión estructural del axón se correlaciona con la pérdida de la capacidad para generar y conducir el potencial de acción (3). La desintegración del citoesqueleto es gatillada por un aumento en la concentración de calcio axoplásmico (4). Se ha postulado que el aumento del calcio libre intraaxonal se relaciona con la patogenia del daño axonal en trauma (5, 6) e isquemia (7,8). Estos estudios sugieren la participación de los canales de calcio voltaje-sensibles (VSCC) y del canal intercambiador de Na⁺/Ca²⁺ en su fisiopatología.

En el segmento distal de la lesión, la pérdida del contacto de las células de Schwann con los axones produce una disminución de los niveles de RNAm de proteínas componentes de la mielina, producidos por la glía. Estas proteínas son la glicoproteína asociada a mielina, la proteína cero y la proteína básica de la mielina. Las células de Schwann se desdiferencian y proliferan con aumento de receptores de factor de crecimiento neural, de proteína acídica fibrilar glial factor de maduración glial-b , molécula de adhesión L1 y molécula de adhesión neural (9).

PAPEL DEL CALCIO EN LA DEGENERACIÓN AXONAL.

La entrada de calcio es un componente necesario para el inicio de la degeneración axonal. La degeneración walleriana no ocurre si la concentración intracelular de calcio libre es menor de 200 mM (5). El aumento del nivel de calcio en el citoplasma activa proteasas calcio-dependiente, las cuales digieren los neurofilamentos, parte importante del citoesqueleto del axón (10,11).

La transección del axón produce entrada de calcio (12,13,14). Diferentes estudios han demostrado que axones dañados mantenidos en un medio con quelante de calcio degeneran más lentamente que los axones en un medio con alta concentración de calcio, con la consiguiente activación de proteasas axonales calcio dependientes (15). También es posible inhibir la degeneración axonal al sustituir el calcio del medio extracelular por cobalto o manganeso, iones que no activan las proteasas calcio-dependientes (16,17).

El mecanismo por el cual los niveles de calcio aumentan en el axoplasma no han sido bien establecidos, pero existen evidencias que apoyan la participación de VSCC axonales en este proceso (18,19).

MECANISMOS DE HOMEOSTASIS DEL CALCIO EN NEURONAS.

Las neuronas utilizan el calcio en el control del crecimiento celular y diferenciación (20), mantención de la estructura del citoesqueleto (21), excitabilidad de la membrana (22), exocitosis y actividad sináptica (23).

En neuronas no depolarizadas la concentración de calcio intracelular libre ([Ca²⁺]_i) es 100 nM, mientras que la concentración de calcio en el espacio extracelular es 2 mM. La gradiente de calcio se mantiene por la interacción de cuatro categorías de eventos: entrada, tamponamiento, almacenamiento en depósitos intracelulares y salida activa de calcio libre al espacio extracelular (24).

Al producirse daño axonal aumenta el flujo de calcio al axolema a través de mecanismos de trasporte calcio-específicos como canales de sodio gatillados por voltaje (25), intercambiador Na⁺/Ca²⁺ (26) y VSCC (5,8). Se ha observado protección contra la degeneración axonal al bloquear VSCC tipo N en conjunto con VSCC tipo L. Los autores han sugerido una baja densidad de VSCC tipo N en relación a VSCC tipo L, por lo que el flujo de calcio en la degeneración estaría dado principalmente por VSCC tipo L. Estos resultados podrían estar influidos por la participación de VSCC tipo T, P/Q o R.

Los VSCC se encuentran en la membrana plasmática de células musculares, neuronas y células gliales (27). Estos canales regulan la entrada de calcio a la célula, mediando funciones fisiológicas, tales como, crecimiento neuronal, regulación enzimática, expresión génica y salida de neurotrasmisores de los terminales nerviosos. Los VSCC se clasifican según sus propiedades electrofisiológicas y farmacológicas en tipos L,T, N, P/Q y R (28).

La activación de los VSCC depende de su localización subcelular y del potencial de membrana local. Por ejemplo, en neuronas piramidales de hipocampo, los canales tipo L se concentran en la base de las dendritas apicales, mientras que los canales tipo N se encuentran ampliamente distribuidos (29).

También existen canales de calcio activados por ligandos. Los receptores ionotrópicos son sensibles a agonistas como NMDA y kainato, los cuales inducen su apertura. La activación de los canales NMDA ha sido asociada a fenómenos de plasticidad sináptica y muerte celular (30).

Los receptores metabotrópicos median la acción de los canales iónicos por mecanismos dependientes de proteínas que unen GTP, con formación de IP₃ y DAG, lo cual moviliza calcio de depósitos intracelulares.

Los bajos niveles de calcio intracelular se mantienen gracias a la acción de proteínas capaces de unir calcio libre como calbindina y parvalbúmina. La capacidad de tamponamiento de las proteínas es limitada. Se ha podido establecer que en neuronas existen mecanismos de secuestro de calcio libre intracelular en organelos (31). Estos incluyen el retículo endoplásmico liso, mitocondrias y vesículas sinápticas (32).

En las neuronas existen diversos mecanismos que permiten eliminar calcio citosólico al extracelular y mantener los niveles de 100 nM contra la gradiente electroquímica. Dentro de estos mecanismos se encuentra el intercambiador Na⁺/Ca⁺² y la bomba de calcio dependiente de ATP, las cuales sacan calcio de la célula o lo almacenan en compartimentos intracelulares, como retículo endoplásmico liso y mitocondrias. El intercambiador de Na⁺/Ca⁺² saca calcio desde el citoplasma al extracelular y lo intercambia por Na⁺, utilizando la gradiente química del sodio sin consumir ATP (33).

Al aumentar la concentración de calcio libre citoplasmático, éste se une a la calmodulina. La calmodulina se une a enzimas como las calmodulina-quinasa y adenilato ciclasa, activándolas. También se activan las calpaínas, las cuales digieren los neurofilamentos del citoesqueleto, por lo que se fragmenta el axolema e inicia la degeneración axonal (fig.1)

Figura 1. MECANISMOS REGULADORES DE LA CONCENTRACIÓN DE CALCIO EN EL ESPACIO INTRACELULAR. Los VSCC forman parte de los mecanismos de homeostasis del calcio neuronal. Una vez activados, entra calcio al espacio intracelular. Si los mecanismos de tamponamiento (calbindina y calmodulina) y salida (intercambiador Na/Ca y bomba ATP dependiente) son superados, se activan proteínas quinasa, fosfolipasa C (PLC) y proteasas calcio-dependientes tipo calpaínas. Uno de los efectos observados es la digestión de los neurofilamentos, lo cual inicia el proceso de degeneración axonal. InsP: inositol fosfato, InsP-R: receptor de inositol fosfato. Ca-BP: proteína unidora de calcio.

CANALES DE CALCIO VOLTAJE-SENSIBLES.

Los VSCC son proteínas compuestas por una subunidad a 1, la cual forma el poro, y unidades accesorias a 2/d y b. Se han identificado seis subunidades a1 diferentes (A, B, C, D, E y S) (34).

Canal de calcio tipo L.

El canal tipo L expresado en el sistema nervioso es activado por potenciales de alto voltaje. Está formado por una subunidad a 1D que forma el poro y las subunidades a 2- d, b y g regulatorias y de anclaje. Las subunidades a1, b y g son codificadas por genes separados, mientras que las subunidades a 2 y d son producto de la proteolisis de un precursor mayor codificado por un solo gen (35). Este canal es bloqueado por 1-4 dihidropiridina (DHP), por fenilalquilamina, y por diltiazem (36).

La subunidad a 1 contiene el sitio de unión de las dihidropiridinas (DHP), moléculas que bloquean la apertura del canal. La secuencia aminoacídica primaria es consistente con una proteína de transmembrana con cinco sitios potenciales de N-glicosilación y sitios de potencial fosforilación dependiente de AMPc.

La subunidad a 2 tiene un peso molecular de 165-220 kDa, el cual disminuye a 130-150 kDa después de la reducción de puentes disúlfuros que la unen con la subunidad g, de 24-33 kDa (37).

La subunidad b tiene un peso de 52-65 kDa. Es un substrato para la proteína quinasa dependiente de AMPc y PKC. Esta unidad se encuentra fuertemente unida a la subunidad a1 y se ha relacionado con la regulación de la actividad del canal tipo L.

La subunidad g del receptor de DHP es una glicoproteína de 30-33 kDa. La subunidad d es de 24-33 kDa. Esta subunidad tiene un domino hidrofóbico transmembrana y se encuentra unida por puentes disulfuros a la subunidad a2. Se desconocen sus funciones dentro del canal. (fig.2)

Figura 2. ESTRUCTURA DE LOS CANALES DE CALCIO VOLTAJE-SENSIBLES. Esquema superior: estructura de subunidad a1. Esta subunidad está formada por cuatro dominios homólogos (I-IV), que contienen seis regiones transmembrana. Los VSCC tipo L presentan un dominio que une dihidropiridina (DHP) en el extremo C-terminal de la zona IV. El esquema inferior representa la interacción entre las subunidades de VSCC, con sitios de glicosilación en el espacio extracelular y sitios de fosforilación (P) en el espacio intracelular.

Canal de calcio tipo N.

El canal de calcio N es activado por potenciales de alto voltaje. Este canal es insensible a DHP. Ha sido descrito sólo en células de origen neuronal y su expresión se encuentra aumentada en células PC12 (línea celular derivada de feocromocitoma de rata) tratadas con factor de crecimiento neural. El canal de calcio N participa en la excitabilidad de membrana, crecimiento axonal, migración neuronal (38) y salida de neurotransmisores (39). Este canal es bloqueado selectivamente por -conotoxina GVIA (40). Consiste en una subunidad 1B de 230 kDa, a2/d de 150 KDa, b3 de 57 kDa y un polipéptido de 94 kDa que no se encuentra en el canal tipo L (41).

En modelos de encefalomielitis autoinmune y esclerosis múltiple se ha encontrado acumulación e integración a la membrana plasmática de subunidad 1B de VSCC tipo N en axones en degeneración. Esta distribución de los canales de calcio podría influir en un aumento del flujo de calcio al axoplasma, contribuyendo al proceso de degeneración axonal (19). Los VSCC tipo L han sido demostrados en los cuerpos celulares de neuronas de ganglios espinales, pero no existe evidencia clara sobre su expresión en membranas axonales.

 

CONCLUSIONES.

Los VSCC se encuentran ampliamente distribuidos en diferentes tipos celulares excitables y no excitables. Corresponden a la principal vía de entrada de calcio en el músculo cardiaco y el músculo liso, participan también en la salida de neurotransmisores desde células endocrinas y neuronas sensitivas, y en procesos de degeneración axonal (5). Por lo tanto estrategias que permitan proteger contra la degeneración axonal inducida por axotomía podrían hacerlo también en neuropatías periféricas. En este sentido existe evidencia que apoya que la inhibición de calpaínas es un elemento protector contra la degeneración axonal por exposición a vincristina (42).

La degeneración axonal es un proceso activo modulable en variadas etapas relacionadas con la homeostasis del calcio intracelular y ,por lo tanto, un blanco interesante para explorar nuevos tratamientos para enfermedades que presentan degeneración axonal tanto en el sistema nervioso central como periférico.

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